American Journal of Innovative Research and Applied Sciences. ISSN 2429-5396 I www.american-jiras.com
PROTOCOL
| Gueyraud Rolland Kipré 1* | Philippe Grellier 2 | and | Allico Joseph Djaman 1,3 |
1. Université Félix Houphouët-Boigny | UFR Biosciences | Laboratoire de Pharmcodynamie Biochimique |Abidjan | Côte d’Ivoire |
2. Muséum National de Paris | EA 3335 Département «Régulation, Développement, Diversité Moléculaire » | USM 0504 «Biologie fonctionnelle des protozoaires »| Paris | France |
3. Institut Pasteur de Côte d’Ivoire | Laboratoire de Biochimie | Abidjan | Côte d’Ivoire |
| Received 06 May 2019 | | Accepted 19 June 2019 | | Published 01 July 2019 | | ID Article | Kipré-Ref.2-ajira040619 |
RESUME
Introduction : La culture in vitro de Plasmodium reste indispensable pour l'identification phénotype et surveillance de l'efficacité des antipaludéens. La culture de Plasmodium falciparum nécessite l’utilisation du milieu Roswell Park Memorial Institute medium 1640 (RPMI 1640), dont l'efficacité dépend de l'addition de sérum humain. Objectif : Ce travail se propose à faire croitre Plasmodium falciparum sur du sérum nom décomplémenté provenant de donneur non paludéen vivant dans une zone d’endémie palustre. Méthode : C’est la variante isotopique du microtest OMS qui a été utilisée dans ce travail. Elle mesure la capacité de doses croissantes d’un antipaludique à inhiber la croissance de Plasmodium dans le milieu de culture (RPMI 1640) contenant du sérum humain. Résultat : Il ressort de cette étude que le milieu de culture avec du sérum non décomplémenté permet la croissance de Plasmodium et peut être utilisé pour des tests de chimiosensibilité. Conclusion : Le paludisme étant une maladie infectieuse qui touche particulièrement l’Afrique subsaharienne, l’utilisation de ce sérum additionné au RPMI est de permettre aux laboratoires du sud avec les moyens dont ils disposent de réaliser une surveillance des souches de P. falciparum circulant dans une zone donnée.
Mots-clés: Antipaludique, Chimisensibilité, Plasmodium falciparu,
ABSTRACT
Introduction: The in vitro culture of Plasmodium remains essential for phenotypic identification and monitoring of antimalarial efficacy. Cultivation of Plasmodium falciparum requires the use of RPMI 1640 medium, the effectiveness of which depends on the addition of human serum. Objective: This work proposes to grow Plasmodium falciparum on serum containing Plasmodium antibodies. Method: This is the isotopic variant of the WHO microtest that was used in this work. It measures the ability of increasing doses of an antimalarial to inhibit the growth of Plasmodium in the RPMI culture medium containing human serum with Plasmodium antibodies. Result: This study shows that culture medium with non-decomplemented serum allows the growth of Plasmodium and can be used for chemosensitivity tests. Conclusion: As malaria is an infectious disease that particularly affects sub-Saharan Africa, the use of this serum added to the RPMI is to allow laboratories in the south with the means at their disposal to monitor P. falciparum strains circulating in sub-Saharan Africa.
Keywords: Antimalarial, Chemisensitivity, Plasmodium falciparu,
1. INTRODUCTION
Dans la lutte contre le paludisme, l'étude in vitro permet d'évaluer la sensibilité intrinsèque des parasites aux antipaludiques et de caractériser au plan épidémiologique la nature des isolats de Plasmodium circulant dans une zone donnée [1]. Cette étude donne la possibilité de mesurer l'efficacité d'un antipaludique sans que n'interviennent les facteurs d'interférences dans la multiplication des parasites telle que l'immunité de l'hôte [2]. La culture de Plasmodium falciparum nécessite un milieu de culture, le Roswell Park Memorial Institute medium 1640 (RPMI 1640), dont l'efficacité est liée à l'addition de sérum humain dépourvu d'anticorps antiplasmodiaux, soit décomplémenté lorsque le sérum provient de sujet, vivant en zone d'endémie palustre [3,4]. En effet, la présence d'anticorps antiplasmodiaux, tout comme les leucocytes dans le sang ajoute ses effets schizonticides à ceux du médicament étudié in vitro.
La croissance des plasmodies est alors impossible par suite d'inhibition des jeunes trophozoïtes [5]. Si le sérum dépourvu d'anticorps est difficilement accessible à cause de son coût élevé, le deuxième type de sérum décomplémenté nécessite un travail supplémentaire de décomplémentation et de stérilisation sur filtre millipore. L'objectif de ce travail est d'évaluer l'efficacité du sérum humain non décomplémenté dans la culture in vitro de souches de P. falciparum.
2. MATERIELS AND METHODES
Trois souches de Plasmodium falciparum PFB et FCB1 (souches résistantes à la chloroquine et sensible à la Pyriméthamine) et K1 (souche résistante à la chloroquine et à la Pyriméthamine) ainsi que des globules rouges sains du groupe 0+ ont servi de matériels biologiques. Ces hématies saines ont servi pour la dilution du sang parasité lorsque la densité parasitaire était supérieure à 8 000 parasites asexués par microlitre de sang. Le RPMI 1640 contenant de l'HEPES 25 mM et du bicarbonate de sodium (NaHCO3) 25 mM a été utilisé comme milieu de culture pour les souches de P. falciparum. L'HEPES et le NaHCO3 jouent un rôle de double tampon et maintiennent le milieu de culture à un pH compris entre 7,2 et 7,4 [6]. A ce milieu de culture, il est ajouté 10% de sérum humain non décomplémenté (contenant des anticorps antiplasmodiaux). Les souches PFB, FCB1 et K1 conservées dans l'azote liquide sont décongelées et maintenues en culture (en absence d'antipaludique) pendant quelques jours afin d'obtenir une bonne densité parasitaire. Avant la culture en présence d'antipaludique, on réalise une synchronisation de la culture par un traitement du sang parasité par du sorbitol à 5% afin d'obtenir pour les tests des parasites au stade de jeunes parasites («ring») uniquement [7].
Le sang est ensuite dilué si nécessaire par des globules rouges non parasités préalablement lavés. Dans la première partie du travail, les souches sont maintenues en culture dans le RPS (RPMI 1640 appauvri en acide folique et contenant 10% de sérum humain non décomplémenté) dans une étuve réglée à 37°C en présence de gaz carbonique et 95% d'humidité pendant 42 heures dans une jarre à bougie [8, 9].
La vérification de la maturation est faite après 42 heures d'incubation par le comptage du nombre de schizontes pour 200 parasites asexués, après lecture des gouttes épaisses réalisées à partir des cultures en absence d’antipaludique.
La deuxième partie de ce travail a été consacrée au test de chimiosensibilité à la pyriméthamine en utilisant le humain non décomplémenté pour vérifier la sensibilité des souches à la pyriméthamine. C’est la variante isotopique du microtest OMS qui a été utilisée dans ce travail [2]. Elle mesure la capacité de doses croissantes d’un antipaludique à inhiber la croissance de Plasmodium dans un milieu de culture (RPMI 1640 contenant du sérum humain). Après 42 heures d’incubation, l'ADN est recueilli après lavage sur un papier de fibre de verre à l’aide d’un collecteur cellulaire, puis, la quantité d’hypoxanthine incorporée par les parasites est mesurée par un compteur à scintillation liquide (WALLAC, 1450 Microbeta TRILUX) en coup par minute. Une droite de régression tracée par un programme à partir de ces valeurs permet de déterminer la CI50 de chaque produit.
3. RESULTS 3. RESULTS Le sérum humain non décomplémenté ajouté au RPMI 1640 de lavage a permis d’obtenir des maturations de trophozoïtes de P. falciparum en schizontes supérieur à 20% (taux de maturation référentiel pour valider la culture in vitro) et ce, quelque soit la souche plasmodiale. Cette maturation est de 77% pour la souche FCB1, 70% pour la souche PFB et de 80% pour la souche K1.Les résultats obtenus dans les tests de chimiosensibilité in vitro des souches dans un milieu contenant du sérum non décomplémenté avoisinent ceux obtenus avec le sérum décomplémenté de la littérature.Tableau 1 : Sensibilité des souches de P. falciparum aux molécules usuelles sur milieu contenant du sérum non décomplémenté.4. DISCUSSION L’intérêt de cette étude était d’obtenir au moins 20% de schizontes dans les cultures sans antipaludique et sans hypoxanthine qui nous ont servi de témoins afin de lancer nos tests isotopiques et de déterminer la CI50 des souches vis-à-vis de la Pyriméthamine sur milieu contenant du sérum non décomplémenté. En effet, si certains auteurs ont démontré le rôle déterminant des anticorps antiplasmodiaux dans l’immunité contre les formes sanguines asexuées de P. falciparum [5], de nombreux travaux ont tenté de déterminer le mode d’action de ces anticorps [10]. Il a été mis en évidence à la surface des globules rouges parasités par P. falciparum, un antigène spécifique appelé antigène HRP2 (Histidine Rich Protein 2) qui est une glycoprotéine avec le galactose comme sucre. La reconnaissance de cette protéine par les anticorps antiplasmodiaux permet de former un complexe qui exerce une action destructrice sur le Plasmodium à l’intérieur du globule rouge. La série de lavage (trois fois) entreprise suivie de centrifugations puis de l’élimination de la couche leuco-plaquettaire avant la mise en culture des parasites, a pour but d’éliminer les protéines HRP2 présentes à la surface des hématies parasitées et nécessaires à la fixation des anticorps et à la formation du complexe anticorpsanti-HRP2. A la fin de ce lavage, nous obtenons des globules rouges dépourvus ou faiblement pourvus de protéines HRP2 ; dès lors le Plasmodium peut subir une maturation par division mitotique de son noyau et atteindre le stade schizontes (stade à plusieurs noyaux). Dans ces conditions, il est possible avec le sérum non décomplémenté, de réaliser un test de chimiosensibilité qui permet de mesurer la capacité de concentrations croissantes d’un antipaludique à inhiber la formation des schizontes. Le paludisme étant une maladie infectieuse qui touche particulièrement l’Afrique subsaharienne [4], l’utilisation du sérum non décomplémenté additionné au RPMI 1640 est de permettre aux laboratoires du sud avec les moyens dont ils disposent de réaliser une surveillance des souches de P. falciparum circulant dans une zone donnée.Il a été possible de réaliser les cultures in vitro de P. falciparum en utilisant un sérum non décomplémenté.Il est également possible de mesurer la sensibilité de ces souches par rapport aux antipaludiques usuels et permettre le criblage systématique de nouvelles substances antipaludiques comme celles issues de la pharmacopée traditionnelle africaine [12, 13] ce qui est un avantage pour les laboratoires du sud5. CONCLUSION Au terme de ce travail nous avons constaté que le sérum non décomplémenté a permis une maturation de 77% pour la souche FCB1, de 70% pour la souche PFB et de 80% pour la souche K1. Avec ce sérum nous avons obtenu des CI50 avec la Chloroquine et la Pyriméthamine qui sont pratiquement identiques avec ceux des auteurs ayant utilisés le sérum décomplémenté.6. REFERENCES 1. Guiguemde TR, Gbary AR, Coulibaly SO, Ouedraogo JB. Comment réaliser et interpréter les résultats d'une épreuve de chimiorésistance de Plasmodium falciparumchez les sujets malades en zone tropicale. Sante 1996 ; 6 : 187-91.2. Rieckmann KH, López-Antuñamo FJ. Chloroquine resistance of Plasmodium falciprumnin Brazil detected by a simple in vitro method. Bull World Health Organ1971 ; 45 : 157-67.3. Schlichtherle M, Wahlgren M, Perlmann H, Scherl A. Methods in Malaria Research. Third Ed. Available from Malaria Research and Reference Resource Center (MR4), Manassas, Virginia USA 2000; 77 p.4. WHO. Paludisme. Aide-mémoire N° 94 révisé Octobre 1998 ; 6 p.5. Danis M, Mouchet J. La réponse immune de l'hôte et l'adaptation du parasite et chimiorésistance des Plasmodiums in Paludisme. Marketing : Ellipses ed., 1991, 240p.6. WHO. Mode d'emploi du nécessaire d'épreuve (Microtest) pour l'évaluation de la réponse de Plasmodium falciparum à la chloroquine et à la méfloquine in vitro.OMS, Genève, MAP/84.2. 1984 ; 9p.7. Lambros C, Vanderberg JP. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J Parasitol 1979 ; 65 : 418-20.8. Le Bras J, Deloron P. in vitro study of drug sensitivity of Plasmodium falciparum: evaluation of a new semi-micro test. Am J Trop Med Hyg 1983 ; 32 : 447-51.9. Le Bras J, Deloron P, Ricour A, Andrieu B, Savel J, Coulaud JP. Plasmodium falciparum: drug sensitivity in vitro of isolates before and after adaptation to continuous culture. Exp Parasitol 1983 ; 56 : 9-14.10. Bruce-Chwatt LJ, Black RH, Canfield GJ, Clyde DF, Peters W, Wernsdorfer WH.Rôle de l'immunité dans la chimiothérapie du paludisme in chimiothérapie du paludisme. 2e édition/OMS ed., Genève, 1984, 274 p.11. Djaman JA, Coulibaly PA, Guédé-Guina F. 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